TEMA: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para el diagnóstico precoz de la infección por Herpes Zoster (VVZ)
OBJETIVO: Analizar biopsias cutáneas de pacientes con herpes zóster y con cambios inespecíficos en la piel para la detección de ADN viral
MUESTRA BIOLÓGICA: biopsias cutáneas en sacabocados de 2 mm
TIPO DE ÁCIDO NUCLÉICO: ADN viral PARES DE BASES DEL VIRUS DE LA VARICELA-ZOSTER (VZV): 126.000 pb
GENES A AMPLIFICAR: ORF VVZ 14, ORF VVZ 29 y ORF VVZ 63.
PARES DE BASES DE CADA GEN A AMPLIFICAR:
- ORF VVZ 14: 336pb
- ORF VVZ 29: 266pb
- ORF VVZ 63: 386pb
- ORF VVZ 63 (PCR anidada): 326pb
EXTRACCIÓN DEL ÁCIDO NUCLÉICO: La PCR se realizó bajo condiciones de reacción estándar. además, se realizó una PCR anidada para la amplificación de ORF VVZ 63. Para la obtención de resultados óptimos la concentración de MgCl2 se ajustó a 1.4 mM (ORF 14), 1.0 mM (ORF 29) y 1.5 mM (ORF 63), respectivamente. El ADN se amplificó en un volumen de reacción total de 50 μl (PCR ORF 29) o 100 μl (PCR ORF 14, PCR ORF 63) con un contenido apropiado de MgCl2, 50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.8), 0.1% NP 40, 10 μg/100 μl BSA, 200 μM de dNTP , 40 pmol de cada primer y 2.5 U Taq PNA polimerasa
TIPOS DE PCR: PCR convencional y Nested PCR
PASOS A REALIZAR:
1. PCR CONVENCIONAL:
La amplificación se realizó con un termosecuenciador Trio Thermocycler de la siguiente forma:- Desnaturalización: por 2 minutos a 94ºC, repetición del ciclo por 1 minuto a 94ºC
- Hibridación: 1.40 minutos a 54ºC (PCR ORF 14), 1.30 minutos a 64ºC (PCR ORF 29) y 1.30 minutos a 49ºC (PCR ORF 63)
- Extensión: 1.45 minutos a 72º
Los pasos 1 a 3 fueron repetidos 40 veces
2. PCR ANIDADA:Se realizó la PCR anidada para ORF 63 mediante la transferencia de alícuotas de 10 μl después de 26 ciclos dentro de 90 μl de una reacción mixta que contenía los primers:
- Desnaturalización: 26 ciclos de 1 minuto a 94ºC
- Hibridación: 1.12 minutos a 54ºC
- Extensión: 1.30 minutos a 72ºC.
VISUALIZACIÓN: mediante electroforesis en gel de agarosa (1.8%) seguida por tinción con bromuro de etidium y Southern blotting
Referencia Bibliográfica:
