Terapia Epigenómica en la enfermedad cerebrovascular hemorrágica

Tema: La metilación del miARN m6A mediada por metiltransferasa 3 promueve la formación de gránulos de estrés oxidativo en la etapa inicial del accidente cerebrovascular

Mecanismo epigenómico: Metilación de mi-ARN 335

Como se lo hizo: In vitro

1. Cultivo de células neuronales de la corteza de roedores neonatales y de células PC12
2. Sometimiento del cultivo a condiciones de lesión de oxígeno-glucosa e inducción de infarto
3. Mediante sistema CRISP-CAS 9 se insertaron los plásmidos pCDH-CMV-METTL3 para expresar la función de la proteína metiltransferasa 3
4. Transfección del miRNA 335 homotípico a las células del cultivo
5. Técnica de inmunofluorescencia de doble marcado para antígeno intracelular de células T (TIA1) y para la proteína 1 ligadora a proteína activadora de GTPasa (G3BP1)
6. Extracción de proteínas y RNA de las células del cultivo para analizar por RT-PCR

Resultados:

• La metilación a través de la enzima METTL3 aumenta la producción y maduración de miR- 335 en un 59.5% en las células cultivadas, promoviendo la formación de SG y reduce el nivel de apoptosis de las neuronas y células lesionadas
• La inmunofluorescencia demostró la formación de gránulos de estrés en un 57.6% en las células cultivadas
• El mi-ARN 335 degrada el ARNm del factor de terminación de la traducción eucariota (Erf1), conllevando a un arresto de la traducción y forma los gránulos de estrés
• Los gránulos de estrés son importantes al detener la traducción de importantes proteínas y ARNm, ya que los protege durante la etapa aguda del accidente cerebrovascular

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 

1) Si W, Li Y, Ye S, Li Z, Liu Y, Kuang W, et al. Methyltransferase 3 mediated miRNA m6A methylation promotes stress granule formation in the early stage of acute ischemic stroke. Front Mol Neurosci [Internet]. 2020 [citado el 1 de septiembre de 2024];13. Disponible en: http://dx.doi.org/10.3389/fnmol.2020.00103

Salto de exón a través de la edición del genoma mediante terapia CRISPR/Cas9

 

Fig. 2. Terapias modificadoras del gen DMD en la distrofia muscular de Duchenne. Recuperado de: http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0025-76802019000700017

Tipo de edición: CRISPR/Cas9 en células somáticas (musculo esquelético y cardiaco) , in vivo

Dirigido hacia: exón mutado 23 del gen DMD (locus Xp21. 2) 

Dirigido por: vectores AAV (serotipo 8 o 9)

Órgano a tratar: músculos esquelético y cardiaco.

Vía de administración: Experimento in vivo, ya sea por vía intramuscular, intraperitoneal o intravenosa.

Resultados: 

A Corto Plazo (1 año)

• Consolidación de ensayos clínicos: Se espera una mayor consolidación de los ensayos clínicos en curso, especialmente aquellos relacionados con terapias génicas (salto de exón,  CRISPR/Cas9) y fármacos que modulen los mecanismos fisiopatológicos asociados a la enfermedad (inflamación, regeneración muscular, etc.).

A Mediano Plazo (3 años)

• Expansión de la terapia génica: Se anticipa una expansión de la terapia génica, con el desarrollo de vectores virales más eficientes y la optimización de las estrategias de administración.

A Largo Plazo (5 años)

• Personalización de tratamientos: Se espera una mayor personalización de los tratamientos, gracias a la identificación de biomarcadores y a una mejor comprensión de la heterogeneidad genética de la DMD y conseguir la prevención de la enfermedad y la mejora de la calidad de vida de los afectados.

 

Referencias bibliográficas: 

1.

Ortez C, Natera De Benito D, Carrera García L, Expósito J, Nolasco G, Nascimento A. Avances en el tratamiento de la distrofia de Duchenne. Medicina (B Aires) [Internet]. 2019 [citado el 25 de agosto de 2024];79:77–81. Disponible en: http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0025-76802019000700017

Efecto del uso de secretoma de células madre mesenquimales sobre heridas cutáneas.

Tema: potencial regenerativo del secretoma de células madre mesenquimales (MSC)  para estimular la proliferación, migración y viabilidad de fibroblastos, células clave en el proceso de cicatrización.

Tipo de Células Madre

El estudio se enfoca en tres tipos principales de células madre mesenquimales:

• Células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (ADSC): Obtenidas del tejido graso.
• Células madre mesenquimales de la pulpa dental (DPSC): Aisladas de la pulpa de los dientes.
• Células madre mesenquimales de la gelatina de Wharton del cordón umbilical (WJSC): Extraídas de la gelatina de Wharton del cordón umbilical.

Figura 2. Esquema del diseño experimental basado en el aislamiento de secretoma de células madre mesenquimales (MSC) de tejido adiposo, pulpa dental y cordón umbilical (ADSC, DPSC, WJSC) para su utilización en protocolos de regeenración a nivel in vitro e in vivo. Recuperado de: https://scielo.isciii.es/scielo.php?pid=S0376-78922022000400003&script=sci_arttext

Método de Obtención de las Células Madre

El método común para obtener las MSC en este estudio procesaron utilizando técnicas de digestión enzimática en una solución de 2 mg/mL de colagenasa tipo I de Clostridium histolyticum (Gibco-Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) durante 6 horas a 37ºC.. El tejido de origen (adiposo, pulpa dental o gelatina de Wharton) se somete a un proceso de digestión enzimática para liberar las células madre mesenquimales, las cuales posteriormente se cultivan en condiciones específicas para su expansión.

Resultados

Corto Plazo:

• Aumento de la viabilidad celular: El secretoma de las MSC incrementó significativamente la viabilidad de los fibroblastos en cultivos in vitro.
• Estimulación de la proliferación celular: El secretoma promovió la proliferación de fibroblastos, especialmente en cultivos tratados con ADSC y DPSC.
• Inducción de la migración celular: Los fibroblastos expuestos al secretoma mostraron una mayor capacidad de migración, lo que es fundamental para la cicatrización de heridas.

Mediano Plazo:

• Aceleración de la cicatrización: En el modelo animal, el tratamiento con secretoma condujo a una cicatrización más rápida de las heridas en comparación con el grupo control.

Largo Plazo:

• Enfermedades neurodegenerativas: Explorar el potencial del secretoma para tratar enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer y el Parkinson, promoviendo la neurogénesis y la reparación neuronal.

• Cáncer: Investigar el uso del secretoma como terapia adyuvante en el tratamiento del cáncer, modulando la respuesta inmunológica y reduciendo los efectos secundarios de la quimioterapia y radioterapia.

Referencias bibliográficas: 

1.

Cases-Perera O, Blanco-Elices C, Martín-Piedra MÁ, Alaminos M, Garzón I. Efecto del uso de secretoma de células madre mesenquimales sobre heridas cutáneas. Análisis comparativo in vitro e in vivo de tres tipos de secretoma. Cir plást ibero-latinoam [Internet]. 2022 [citado el 18 de agosto de 2024];48(4):367–76. Disponible en: https://scielo.isciii.es/scielo.php?pid=S0376-78922022000400003&script=sci_arttext

Ejemplo de animal transgénico

Tema: Destacar el modelo de ratones TRAMP como una excelente manera de encontrar nuevas oportunidades para la quimioprevención y los enfoques terapéuticos, estableciendo nuevas perspectivas en los estudios del cáncer de próstata.

Tipo de animal transgénico: ratones TRAMP Knockout

Método de obtención: mediante un silenciamiento de genes (splicing) utilizando el promotor mínimo de probasina de rata (−426/+28) para apuntar a la expresión grande del virus TSV40 y las oncoproteínas pequeñas t, solo en el epitelio prostático, inactivando la actividad supresora de tumores p53 y Rb en ​​la próstata

Uso: Este modelo es capaz de desarrollar un cáncer de próstata progresivo con independencia androgénica y diseminación metastásica, con el afán de:monitorear la progresión de la lesión prostática en poco tiempo
determinar la caracterización morfológica del tejido prostático y otros órganos
monitorear el metabolismo del cáncer
llegar con un diagnóstico, una prevención y/o un tratamiento
descubrir nuevos fármacos que le hagan frente al cáncer de próstata (1)

Figura 1: Ilustración esquemática que muestra las principales lesiones en ratones TRAMP durante la progresión del cáncer de próstata y la respuesta del microambiente prostático después de un bloqueo inflamatorio y angiogénico.

Obtenido de: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0024320518307859?via%3Dihub

Ventajas de los animales transgénicos

1. Los animales transgénicos pueden superar enfermedades infecciosas
2. Producción de fármacos
3. Avances en estudios de enfermedades animales y humanas, como el cáncer
4. Creación de bancos genéticos para evitar la extinción de las especies
5. Reducir la pérdida de animales (2)

Desventajas de los animales transgénicos

1. Al modificar especies ya existentes podemos poner en riesgo especies autóctonas
2. Se usan animales vivos, por lo que es primordial hacer un examen ético y determinar cómo de novedoso e importante pueden ser los resultados del experimento
3. La expresión de nuevas proteínas donde antes no existían puede provocar la aparición de alergias.
4. Sufrimiento de los animales durante la experimentación
5. Pérdida del patrimonio genético que garantiza la biodiversidad (2)

Referencias Bibliográficas:

1. Kido LA, de Almeida Lamas C, Maróstica MR Jr, Cagnon VHA. Transgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate (TRAMP) model: A good alternative to study PCa progression and chemoprevention approaches. Life Sci [Internet]. 2019;217:141–7. [citado el 27 de julio de 2024]. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.lfs.2018.12.002

2. Maqueda AD. Animales transgénicos - Definición, ejemplos y características [Internet]. expertoanimal.com. 2018 [citado el 27 de julio de 2024]. Disponible en: https://www.expertoanimal.com/animales-transgenicos-definicion-ejemplos-y-caracteristicas-23679.html

ADN Recombinante Natural y Artificial

 ADN Recombinante en la naturaleza

La recombinación es el mecanismo principal a través del cual se introduce variación en las poblaciones. Dos moléculas de ADN que posean distintas mutaciones pueden intercambiar segmentos y dar lugar a la aparición de nuevas combinaciones genéticas. Las bacterias y los virus, al igual que las eucariotas también tienen mecanismos de recombinación. Se puede decir que las bacterias sufren varios tipos de trasformaciones de genes entre especies no afines. La transformación permite a la batería capturar DNA libre del ambiente (1)

ADN Recombinante artificial en la enfermedad de Chagas

T: Mycobacterium bovis BCG recombinante es una plataforma prometedora para desarrollar vacunas contra la infección por Trypansoma cruzi

O: desarrollar una vacuna candidata para proteger contra la infección de T. cruzi, utilizando la plataforma de vacuna BCG recombinante (rBCG).

G: TS (AJ276679) y CZ (XM_800858.1)

ER: Xbal y HindIII

EL: DNA T4

V:  pUS977 y pUS2000

CR: Procariota E. coli y M. bovis BCG

MTG: Conjugación bacteriana a través de Luria-Bertani y Middlebrook.

MIC: Los transformadores de BCG fueron seleccionada en medio 7H10 con kanamicina y cultivada en medio selectivo 7H9 durante 5 días. La expresión de las proteínas recombinantes fue hecha mediante western blot, sueros hiperinmunes en ratón, anticuerpo específico anti-gamma de ratón conjugado con peroxidasa (Sigma-Aldrich) y PCR

Figura 1: Western blot que demuestra la expresión de los antígenos TS y CZ por M. bovis 

BCG Obtenido de:sci-hub.se/10.1111/cei.13469

Referencias Bibliográficas:

1. Teresa Audesirk, Gerald Audesirk, Bruce E. Biologia la vida en la tierra. EBooks.[Internet].  [Citado el 21 de julio de 2024]. 6ta edición, cap. 13. Disponible en: https://books.google.com.ec/books?id=uO48-6v7GcoC&pg=PA244&lpg=PA244&dq=ADN+recombinante+en+las+bacterias+de+forma+natural&source=bl&ots=vVqCJPZHRA&sig=WBu36UFESD1uPjQoLyfFckTUlvI&hl=es&sa=X&ei=Ol_BUO3RMI6-9QTI-YCoBw#v=onepage&q=ADN%20recombinante%20en%20las%20bacterias%20de%20forma%20natural&f=false
2. Bontempi Y, Leal K, Prochetto E, Dìaz G, Cabrera G, Bartolotti A, et al. Recombinant Mycobacterium bovis BCG is a promising platform to develop vaccines against Trypansoma cruzi infection [Internet]. 2020. PubMed. [Citado el 21 de julio de 2024]. Disponible en: sci-hub.se/10.1111/cei.13469

Técnica western blot usada en el diagnóstico de la borreliosis de Lyme

 

Figura 1 . Perfiles de inmunotransferencia típicos para los controles positivos y para los sueros de pacientes con síntomas específicos de borreliosis de Lyme : 1, IgG de control positivo; 2, IgM de control positivo; 3, paciente con artritis IgG; 4, paciente con ACA IgG; 5, paciente con neuroborreliosis IgG; 6, paciente con neuroborreliosis Igh4; 7, paciente con eritema migratorio IgG; 8, paciente con eritema migratorio IgM. Recuperado de: https://sciencedirect.com/science/article/pii/S1198743X14650060

La Borrelia burgdorferi es la bacteria responsable de la borreliosis de Lyme, una enfermedad que afecta múltiples sistemas del cuerpo. La técnica de Western blot se utiliza para analizar la respuesta inmune humoral en esta enfermedad y sirve como prueba serodiagnóstica de confirmación. Las proteínas inmunodominantes más relevantes de Borrelia burgdorferi incluyen las de 94 kDa, 60 kDa, 41 kDa (flagelina), 34 kDa (Osp B), 31 kDa (Osp A), 30 kDa, 21 kDa (Osp C) y 17/18 kDa.

Referencias bibliográficas:

1.Ryffel K, Péter O, Binet L, Dayer E. Interpretation of immunoblots for Lyme borreliosis using a semiquantitative approach. Clin Microbiol Infect [Internet]. 2018;4(4):205–12. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1111/j.1469-0691.1998.tb00670.x

Técnicas de PCR en el diagnóstico de la infección por Herpes Zoster (VVZ)

TEMA: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para el diagnóstico precoz de la infección por Herpes Zoster (VVZ)

OBJETIVO: Analizar biopsias cutáneas de pacientes con herpes zóster y con cambios inespecíficos en la piel para la detección de ADN viral

MUESTRA BIOLÓGICA: biopsias cutáneas en sacabocados de 2 mm

TIPO DE ÁCIDO NUCLÉICO: ADN viral 

PARES DE BASES DEL VIRUS DE LA VARICELA-ZOSTER (VZV): 126.000 pb

GENES A AMPLIFICAR: ORF VVZ 14, ORF VVZ 29 y ORF VVZ 63.

PARES DE BASES DE CADA GEN A AMPLIFICAR:

• ORF VVZ 14: 336pb
• ORF VVZ 29: 266pb
• ORF VVZ 63: 386pb
• ORF VVZ 63 (PCR anidada): 326pb

EXTRACCIÓN DEL ÁCIDO NUCLÉICO: La PCR se realizó bajo condiciones de reacción estándar. además, se realizó una PCR anidada para la amplificación de ORF VVZ 63. Para la obtención de resultados óptimos la concentración de MgCl2 se ajustó a 1.4 mM (ORF 14), 1.0 mM (ORF 29) y 1.5 mM (ORF 63), respectivamente. El ADN se amplificó en un volumen de reacción total de 50 μl (PCR ORF 29) o 100 μl (PCR ORF 14, PCR ORF 63) con un contenido apropiado de MgCl2, 50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.8), 0.1% NP 40, 10 μg/100 μl BSA, 200 μM de dNTP , 40 pmol de cada primer y 2.5 U Taq PNA polimerasa

TIPOS DE PCR: PCR convencional y Nested PCR

PASOS A REALIZAR: 

1. PCR CONVENCIONAL:

La amplificación se realizó con un termosecuenciador Trio Thermocycler de la siguiente forma:

1. Desnaturalización: por 2 minutos a 94ºC, repetición del ciclo por 1 minuto a 94ºC
2. Hibridación: 1.40 minutos a 54ºC (PCR ORF 14), 1.30 minutos a 64ºC (PCR ORF 29) y 1.30 minutos a 49ºC (PCR ORF 63)
3. Extensión: 1.45 minutos a 72º

Los pasos 1 a 3 fueron repetidos 40 veces

2. PCR ANIDADA:

Se realizó la PCR anidada para ORF 63 mediante la transferencia de alícuotas de 10 μl después de 26 ciclos dentro de 90 μl de una reacción mixta que contenía los primers:

1. Desnaturalización: 26 ciclos de 1 minuto a 94ºC
2. Hibridación: 1.12 minutos a 54ºC 
3. Extensión:  1.30 minutos a 72ºC.

VISUALIZACIÓN: mediante electroforesis en gel de agarosa (1.8%) seguida por tinción con bromuro de etidium y Southern blotting 

Referencia Bibliográfica:

1.Reacción en Cadena DE polimerasa para El diagnóstico precoz DE la infección por herpes zoster [Internet]. Siicsalud.com. [citado el 16 de junio de 2024]. Disponible en: https://www.siicsalud.com/des/expertoimpreso.php/67332

Lupus eritematoso sistemático

 

Es una enfermedad autoinmune en la cual el sistema inmune ataca al tejido sano de diversos órganos como el corazón, el cerebro ,etc. Los genes afectados se asocian al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), especialmente el alelo HLA-DR3 y HLA-DR2.  Las alteraciones epigenéticas en pacientes con LES, incluyen cambios en los patrones de metilación del ADN y modificaciones de las histonas lo que afecta la expresión de genes relacionados con el sistema inmunitario y la respuesta inflamatoria.

Mdpi-res.com. Disponible en: https://pub.mdpi-res.com/cells/cells-11-00506/article_deploy/html/images/cells-11-00506-ag.png?1643709687

Referencias bibliográficas:

1.Adams DE, Shao W-H. Epigenetic alterations in immune cells of systemic lupus erythematosus and therapeutic implications. Cells [Internet]. 2022 [citado el 9 de junio de 2024];11(3):506. Disponible en: https://www.mdpi.com/2073-4409/11/3/506

Fibrosis quística

 

     Enfermedad genética hereditaria, la mutación más conocida como F508del que implica la eliminación de un aminoácido, fenilalanina, en la posición 508 de la proteína CFTR ocasionando que no se pliegue correctamente durante su síntesis  por lo que no puede cumplir su función normal de regular el transporte de cloruro y otros iones a través de las membranas celulares, lo que resulta en la acumulación de moco espeso y pegajoso en los pulmones, el tracto digestivo y otros órganos.

Núñez Huasaf JA. Fibrosis quística: aspectos genéticos. 

Medwave [Internet]. 2005;5(1). Recuperado de: http://dx.doi.org/10.5867/medwave.2005.01.3372

Referencias bibliográficas:

1.Lay-Son G, Repetto DG. Genética y fibrosis quística: Desde el gen CFTR a los factores modificadores [Internet]. Cloudfront.net. [citado el 2 de junio de 2024]. Disponible en: https://d1wqtxts1xzle7.cloudfront.net/50659366/Gentica_y_fibrosis_qustica_Desde_el_gen_20161201-9461-h267zc-libre.pdf?1480605897=&response-content-disposition=inline%3B+filename%3DGenetica_y_fibrosis_quistica_Desde_el_ge.pdf&Expires=1717343691&Signature=EiD0SPSuOKwNrwIolIA6hygUpYuY1Tpg7rG0G20Rkxd87cRbV1pShZkt~IxmCo31ZrLhKtgCDy4G-XqYhPqxQL0tW2wXbMRE59vwZUsq~T9GxITjeXV7GanAAKnptQY46pONTFaq5VBi4-8~RC2tU-CkORee2CmCzttGB5OB9ty7xNYZ6dloh6ZdPeyhrziPAasCklcofaa5VUfm3bRmFFILQwjekfAanIMqdA6YTHrZnEyXC6mO3DTAHFEZnpGKyDrNwuUKNH5gQ4EvcfJwDdAcsIyXyb0buOWHujbpDF9xb6E78owPuGE-OD6Hm4vwyuy97N3ydFZF859bee2a~Q__&Key-Pair-Id=APKAJLOHF5GGSLRBV4ZA

Osteoartritis

1. 

[Internet]. 2022 [citado 26 mayo 2022]. Disponible en: https://medlineplus.gov/spanish/ency/images/ency/fullsize/17105.jpg

Enfermedad articular degenerativa que afecta tanto al cartílago como al hueso subcondral, su etiología es variada abarcando factores del entorno, metabólicos y por su puesto el factor genético en los cuales en estudios recientes se ha determinado que tiene una herencia poligenética (hasta 12 genes asociados)  COL9A2, COL11A1, COL11A2 o COMP que son los principales que codifican para el colágeno Tipo 2, es cuál se ve afectado en esta enfermedad.

Referencias bibliográficas

2. Aubourg G, Rice SJ, Bruce-Wootton P, Loughlin J. Genética de la osteoartritis. Cartílago de osteoartritis [Internet]. 2022 [citado el 26 de mayo de 2024];30(5):636–49.

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33722698/

Distrofia muscular de Duchenne

 

Es el tipo más común de distrofia y esta asociada al cromosoma x, en el cual se ve afectado el gen DMD ya sea por deleciones, duplicaciones o inserciones. Este gen es el encargado de codificar para la proteína distrofina que cumple una función estructural en el sarcolema de las fibras musculares por lo tanto esta enfermedad grave provoca perdida progresiva de las funciones motoras del todo el cuerpo, problemas respiratorios, escoliosis, fatiga, problemas cardiacos, etc.

Referencias bibliográficas:

1.	Fortunato F, Farnè M, Ferlini A. The DMD gene and therapeutic approaches to restore dystrophin. Neuromuscul Disord [Internet]. 2021 [citado el 19 de mayo de 2024];31(10):1013–20. Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34736624/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34736624/

Presentación

 ¡Bienvenidos al blog estudiantil de biología molecular en la carrera de medicina! Aquí exploraremos los misterios del mundo molecular, desde la genética hasta las últimas investigaciones en biología celular. Prepárense para sumergirse en el fascinante universo de las moléculas que conforman la vida y descubrir su impacto en la medicina moderna. ¡Bienvenidos a un viaje de descubrimiento y aprendizaje en el corazón de la biología molecular!